第11章 肿瘤的分子诊断 .doc
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参见附件(83kb)。
第十一章 肿瘤的分子诊断
第一节 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用
一、肿瘤易感基因的检测
明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤有
Rbl(视网膜母细胞瘤)、WTl(肾母细胞瘤)、p53(Li-Fraumeni综合征)、APC(家族性腺瘤性息肉病)、HNPCC(遗传性非息肉病性结肠癌)、NFl(神经纤维瘤病)、VHL(Von Hippel-Lindau综合征)、PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和Cowden综合征)、BRCAl(乳腺癌)等。
二、肿瘤的分类
* 判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源，常规病理组织学方法不易区分 的
* 如使用限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)基因的重排情况，则可进行鉴别诊断。
* B细胞起源的淋巴瘤常有Ig?链或?链的基因重排，而T细胞起源的淋巴瘤则常有TCR?链或?链的基因重排，这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。
三、肿瘤的早期诊断
K-Ras基因突变是一种在胰腺癌、结肠癌和肺癌中发生率较高的分子病变事件，应用细针穿刺活检材料检测胰腺癌，检出率达100%。应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中Ras基因突变，其检出率与肿瘤组织中的检测丰相似
四、肿瘤的预后判断
* 肿瘤相关基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关
* 如p53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后相关，* 肿瘤转移抑制基因nm23的状态则与肿瘤转移相关。
* 如Vogelstein根据结肠癌相关基因的变化，提出了肠癌癌变和演进的致癌模型，阐述了癌基因激活、抑癌基因失活与肠上皮细胞增生、癌前状态、癌变和转移各阶段基因变化的特征
五、肿瘤的个体化和预见性治疗
* 肿瘤的发生是多基因累积、多步骤、多阶段的过程，在肿瘤发生、发展的不同时期，可能涉及不同的基因和不同的变化形式
* 基因的变化和基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切关联，如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，则对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义，可提高肿瘤临床治疗的效果。
* 如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺痛存在Ras基因的激活，对放疗具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常基因的状态，则可提高放疗敏感性。
六、肿瘤的预后监测
应用PCR技术检测周围血中的肿瘤细胞，可提高对肿瘤转移监测的准确性。
分子诊断的高敏感性有助于及时采取适当的治疗措施和治疗方案。
肿瘤的分子诊断主要集中于对癌基因、抑癌基因及相关基因的检测，分别在蛋白质、RNA和DNA水平进行判断。
第二节 肿瘤基因过表达及其检测
一、基因过表达的形式
* 癌基因的激活有多种表现形式，其中基因产物过表达为重要的形式之一。
* 癌基因一般为单拷贝基因，有其编码的蛋白质，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制过程中形成多个拷贝，形成双微粒染色体和均染区，这种基因的扩增常产生基因产物过表达，表现为mRNA和蛋白质量的增加。
* p53基因，由于其野生型基因产物半衰期短而不易检测到，但突变后，不仅起到癌基因的作用，其产物突变型的p53蛋白半衰期也延长，应用一定的方法可在肿瘤细胞内检测到过表达的p53蛋白。
二、基因过表达的检测
(一)表达产物的检测
* 无论癌基因或抑癌基因，其蛋白产物的过表达可以应用相应的抗体，应用免疫组织化学、ELISA、Westernblot方法，检测肿瘤细胞或血清中的蛋白产物。
* 流式细胞仪(flowcytometry)测试法，首先标记荧光于相应的抗体蛋白，标记有荧光的抗体蛋白与含有特异抗原的细胞结合后，用流式细胞仪对含不同荧光信号的细胞进行分类、测试。
* 影像细胞测试法则可应用特定波长的光密度进行积分，从而得到特定蛋白质的含量。
* 乳腺癌组织中c-ErBb-2表达阳性率可达50%左右
* p53基因表达产物在大多数肿瘤中都有过表达
(二)基因扩增的检测
* 肿瘤基因的扩增可产生过量的表达蛋白，此外，还可表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，经典的方法为核酸分子杂交，包括原位杂交(in situ hybridization, ISH)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、Southern blot(DNA杂交)、Northern blot(RNA杂交)、原位PCR、反转录P CR等。
* 原位杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，属于固相核酸分子杂交范围，它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。
* 荧光原位杂交(FISH)是将荧光素标记克隆的DNA片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测定该特定的DNA片段是否有缺失或扩增。
* 比较基因组杂交(comparative genome hybridization)，即将荧光素分别标记在去除了重复序列的肿瘤及正常细胞基因组DNA上，然后分别与正常染色体进行原位杂交，对该二种不同探针与各个染色体杂交后的信号进行比较，以了解该肿瘤中细胞在不同染色体上缺失或扩增的状态。
* 原位PCR(in situ polymerase chain reaction)原位PCR技术就是PCR扩增技术和原位杂交技术相结合，通过PCR技术对靶核苷酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使基因拷贝数放大，再通过原位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。原位PCR可用于DNA和RNA(RT-PCR)的检测。原位PCR作为形态学和细胞分子生物学前沿交叉的产物，对学科前沿研究和交叉学科的发展起着巨大的作用，Anderson曾于1994年生动指出"原位PCR使光学显磁镜超过电子显微镜在向生物化学和遗传学领域延伸。
* Southern杂交是1975年由Southern提出并以其名宇命名的一种DNA特定序列定位技术。基本原理为：从组织或细胞中获取基因组DNA，用一种或多种限制性内切酶酶切，通过电泳、转印、原位变性固定于一固相支持物，用已标记的特异性的DNA或RNA的探针与固定有DNA的固相支持膜杂交，经放射自显影或化学发光自显影，对显影条带进行分析。
* Southern方法出现后不久，1977年Alwine等提出一种类似于Southern的方法，用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，为与Southern相对应而命名为Northem杂交。Northern杂交的基本程序与Southern杂交相似，提取组织或细咆中的RNA，但不需酶切而直接采用变性电泳 ......
第十一章 肿瘤的分子诊断
第一节 分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用
一、肿瘤易感基因的检测
明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤有
Rbl(视网膜母细胞瘤)、WTl(肾母细胞瘤)、p53(Li-Fraumeni综合征)、APC(家族性腺瘤性息肉病)、HNPCC(遗传性非息肉病性结肠癌)、NFl(神经纤维瘤病)、VHL(Von Hippel-Lindau综合征)、PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和Cowden综合征)、BRCAl(乳腺癌)等。
二、肿瘤的分类
* 判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源，常规病理组织学方法不易区分 的
* 如使用限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)基因的重排情况，则可进行鉴别诊断。
* B细胞起源的淋巴瘤常有Ig?链或?链的基因重排，而T细胞起源的淋巴瘤则常有TCR?链或?链的基因重排，这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。
三、肿瘤的早期诊断
K-Ras基因突变是一种在胰腺癌、结肠癌和肺癌中发生率较高的分子病变事件，应用细针穿刺活检材料检测胰腺癌，检出率达100%。应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中Ras基因突变，其检出率与肿瘤组织中的检测丰相似
四、肿瘤的预后判断
* 肿瘤相关基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关
* 如p53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后相关，* 肿瘤转移抑制基因nm23的状态则与肿瘤转移相关。
* 如Vogelstein根据结肠癌相关基因的变化，提出了肠癌癌变和演进的致癌模型，阐述了癌基因激活、抑癌基因失活与肠上皮细胞增生、癌前状态、癌变和转移各阶段基因变化的特征
五、肿瘤的个体化和预见性治疗
* 肿瘤的发生是多基因累积、多步骤、多阶段的过程，在肿瘤发生、发展的不同时期，可能涉及不同的基因和不同的变化形式
* 基因的变化和基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切关联，如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，则对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义，可提高肿瘤临床治疗的效果。
* 如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺痛存在Ras基因的激活，对放疗具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常基因的状态，则可提高放疗敏感性。
六、肿瘤的预后监测
应用PCR技术检测周围血中的肿瘤细胞，可提高对肿瘤转移监测的准确性。
分子诊断的高敏感性有助于及时采取适当的治疗措施和治疗方案。
肿瘤的分子诊断主要集中于对癌基因、抑癌基因及相关基因的检测，分别在蛋白质、RNA和DNA水平进行判断。
第二节 肿瘤基因过表达及其检测
一、基因过表达的形式
* 癌基因的激活有多种表现形式，其中基因产物过表达为重要的形式之一。
* 癌基因一般为单拷贝基因，有其编码的蛋白质，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制过程中形成多个拷贝，形成双微粒染色体和均染区，这种基因的扩增常产生基因产物过表达，表现为mRNA和蛋白质量的增加。
* p53基因，由于其野生型基因产物半衰期短而不易检测到，但突变后，不仅起到癌基因的作用，其产物突变型的p53蛋白半衰期也延长，应用一定的方法可在肿瘤细胞内检测到过表达的p53蛋白。
二、基因过表达的检测
(一)表达产物的检测
* 无论癌基因或抑癌基因，其蛋白产物的过表达可以应用相应的抗体，应用免疫组织化学、ELISA、Westernblot方法，检测肿瘤细胞或血清中的蛋白产物。
* 流式细胞仪(flowcytometry)测试法，首先标记荧光于相应的抗体蛋白，标记有荧光的抗体蛋白与含有特异抗原的细胞结合后，用流式细胞仪对含不同荧光信号的细胞进行分类、测试。
* 影像细胞测试法则可应用特定波长的光密度进行积分，从而得到特定蛋白质的含量。
* 乳腺癌组织中c-ErBb-2表达阳性率可达50%左右
* p53基因表达产物在大多数肿瘤中都有过表达
(二)基因扩增的检测
* 肿瘤基因的扩增可产生过量的表达蛋白，此外，还可表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，经典的方法为核酸分子杂交，包括原位杂交(in situ hybridization, ISH)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、Southern blot(DNA杂交)、Northern blot(RNA杂交)、原位PCR、反转录P CR等。
* 原位杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，属于固相核酸分子杂交范围，它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。
* 荧光原位杂交(FISH)是将荧光素标记克隆的DNA片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测定该特定的DNA片段是否有缺失或扩增。
* 比较基因组杂交(comparative genome hybridization)，即将荧光素分别标记在去除了重复序列的肿瘤及正常细胞基因组DNA上，然后分别与正常染色体进行原位杂交，对该二种不同探针与各个染色体杂交后的信号进行比较，以了解该肿瘤中细胞在不同染色体上缺失或扩增的状态。
* 原位PCR(in situ polymerase chain reaction)原位PCR技术就是PCR扩增技术和原位杂交技术相结合，通过PCR技术对靶核苷酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使基因拷贝数放大，再通过原位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。原位PCR可用于DNA和RNA(RT-PCR)的检测。原位PCR作为形态学和细胞分子生物学前沿交叉的产物，对学科前沿研究和交叉学科的发展起着巨大的作用，Anderson曾于1994年生动指出"原位PCR使光学显磁镜超过电子显微镜在向生物化学和遗传学领域延伸。
* Southern杂交是1975年由Southern提出并以其名宇命名的一种DNA特定序列定位技术。基本原理为：从组织或细胞中获取基因组DNA，用一种或多种限制性内切酶酶切，通过电泳、转印、原位变性固定于一固相支持物，用已标记的特异性的DNA或RNA的探针与固定有DNA的固相支持膜杂交，经放射自显影或化学发光自显影，对显影条带进行分析。
* Southern方法出现后不久，1977年Alwine等提出一种类似于Southern的方法，用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，为与Southern相对应而命名为Northem杂交。Northern杂交的基本程序与Southern杂交相似，提取组织或细咆中的RNA，但不需酶切而直接采用变性电泳 ......
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